- •Глава1.
- •Частьii.Собственныеисследования
- •Глава2. Материалыиметоды…………………………………………502.1.Общаяхарактеристикабольных……………………………………………50
- •Глава3.Результатыисследования………………………………...74
- •Глава4.Обсуждениеполученныхрезультатов…………. 221
- •Списоксокращений
- •Введение Актуальностьпроблемы
- •Научнаяновизнаисследования
- •Практическаязначимость
- •Основныеположения,выносимыеназащиту
- •Внедрениерезультатов работывпрактическоездравоохранение
- •Апробацияработы
- •ГлаваI обзорлитературы
- •ЭтиологияипатогенезИап
- •Классификация,клиническиеособенности иап
- •Пузырчаткавульгарная(Pemphigusvulgaris)
- •Пузырчаткалистовидная(эксфолиативная) /Pemphigusfoliaceus/
- •Паранеопластическаяпузырчатка(Paraneoplasticpemphigus)
- •1.5.1Общиепредставленияомолекулярной фармакологииСгк
- •СтроениеГр:
- •ИзоформыГр:
- •ЛечениебольныхИап
- •АдьювантнаятерапиябольныхИап
- •Азатиоприн
- •ЦиклоспоринA
- •Метотрексат
- •МофетилМикофенолат
- •Циклофосфамид
- •Никотинамидитетрациклин
- •Соли золота
- •Внутривенный иммуноглобулин
- •Пиридостигминабромид
- •Стероиднаярезистентность
- •Механизмы стероидной резистентности на рецепторномуровне
- •Механизмыстероиднойрезистентностинапострецепторномуровне
- •ЧастьIi.Собственныеисследования
- •Глава2.Материалыиметодыисследования
- •Общаяхарактеристикабольных
- •Характеристика больных иап, находившихся поднепосредственнымнаблюдением
- •ИзучениекатамнестическихданныхбольныхИап
- •2.1.3. Изучение клинических данных больных для определениямолекулярныхмеханизмовстероиднойрезистентности
- •МужчиныЖенщины
- •В%соотношении
- •Оборудование
- •Изучениехарактерасвязываниясмембраннымирецепторамипо
- •Исследование связывания меченого сгк внутриклеточными
- •Полимеразно-цепнаяреакцияврежимереальноговремени
- •Описаниеметода:
- •Исследование молекулярных механизмов стероиднойрезистентности напострецепторномуровне
- •Реактивы
- •Оборудование
- •Приготовлениереактивов
- •Полимеразно-цепнаяреакция
- •Определениефакторанекрозаопухолиα (tnf-α)
- •Радиоизотопныйметод
- •Постановкарадиоизотопногометода
- •Жидкостнаясцинтилляционнаярадиометрия
- •Статистическаяобработкарезультатовисследования
- •Глава3.Результатыисследования
- •Ретроспективный анализисторийболезнибольныхИап
- •Общая характеристикаклиническихданныхбольныхИап
- •Количествобольныхв%соотношении
- •% Отр. 52 Положит. 48 46
- •КоличествоСр(-)больныхИап в%соотношении
- •Нетадювантнойтерапии
- •Такимобразом:
- •3.1.2. ХарактеристикастероидчувствительныхбольныхИап
- •КоличествоСр(-)больныхИаПв %соотношении 60%
- •КоличествоСр(-)больныхИап в%соотношении
- •% Отр. 58 Положит. 42 0
- •КоличествоСр(-)больных иаПв%соотношении 80%
- •КоличествоСр(-)больныхИаПв %соотношении 100%
- •Такимобразом:
- •3.1.3.ХарактеристикастероидрезистентныхбольныхИап
- •%Соотношении
- •В%соотношении
- •Онкология
- •Такимобразом:
- •КоличествобольныхИаПв% соотношении 60%
- •КоличествобольныхИаПв% соотношении 100%
- •КоличествобольныхИаПв% соотношении
- •КоличествоСр(-)больныхИаПв %соотношении 80%
- •Такимобразом:
- •Молекулярныемеханизмыстероиднойрезистентностинарецепторномуровнеубольныхистиннойакантолитическойпузырчаткой
- •ИзучениеуровняэкспрессиимРнКα-иβ-изоформглюкокортикоидныхрецепторовустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольныхИап
- •Бетарецептор альфарецептор
- •3.2.2АнализклиническихданныхбольныхИаПприизменениинауровнеα-иβ-изоформглюкокортикоидныхрецепторов
- •3.2.3.Изучениеколичествамембранныхивнутриклеточныхрецепторовустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольных
- •10*3/Клетку
- •10*3/Клетку
- •3.2.4АнализклиническихданныхбольныхИаПприизменениимембранныхивнутриклеточныхрецепторов
- •МолекулярныемеханизмыстероиднойрезистентностинапострецепторномуровнеубольныхИап
- •ИзучениевключениямеченогоуридинавРнКлимфоцитовпериферическойкровиустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольныхИап
- •Количествовключенногоуридинав
- •Значимыйпоказатель
- •АнализклиническихданныхбольныхИаПприизменениивключения ³н-уридина
- •3.4.РазработкалечениябольныхИаПазатиоприномпристероиднойрезистентности
- •3.4.1Клиническиеданныеприпримененииазатиоприна
- •MaxдозаСгк
- •2 Раза
- •ДинамикакожныхвысыпанийубольныхИаПприлеченииазатиоприномвсочетаниисСгк
- •Осложнения,возникшиеустероидрезистентныхбольныхИаПприлеченииазатиоприномвсочетаниисСгк
- •ИзучениеэкспрессиигенаNf-kBустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольныхИаПиеединамикинафонетерапииазатиоприном
- •ЭкспрессиягенаNFkB относительногеновэкспрессииGapdhв% 90
- •Интервалзначений
- •ЭкспрессиягенаNFkB относительногеновэкспрессии
- •Интервалзначений
- •ЭкспрессиягенаNf-kBотносительно экспрессиигеновGapdhв% 90
- •АнализклиническихданныхстероидрезистентныхбольныхИап приизмененииэкспрессиигенаNf-kBнафонетерапииазатиоприном
- •Определениефакторанекрозаопухолиα(tnf-α)убольныхИап
- •Клиническиепримеры больныхИап
- •Патологоанатомический диагноз.Комбинированноеосновноезаболевание.
- •Проведены обследования:
- •60 Преднизолона
- •Преднизолон Метипред
- •Длительностьприемапрепарата
- •Былпроведенонкопоиск:
- •Заключительный клинический диагноз:
- •Глава4.Обсуждение полученных результатов
- •Практическиерекомендации
- •Библиография
Исследование молекулярных механизмов стероиднойрезистентности напострецепторномуровне
ОбъектомисследованияпослужилагруппапациентовсоСР(-)(n=10)иСР(+)формамиИАП(n=14).
Реактивы
Вработеиспользовалисьследующиереактивы:фиколл-400–полисахарид(«ДНК-Технология»,Россия),уротраст-рентгеноконтрастноевещество(«ДНК-Технология»,Россия),среда199(«ППБВПРАМН»,Россия),стерильнаядистиллированнаявода,3%растворуксуснойкислоты,[³Н]-уридин(5мкCi/ммоль)(«ИВСРАН»,Санкт-Петербург),преднизолон(«Merck»,Германия),дигитонин(«ЗАОАлтайвитамины»,Россия),HEPES-буфер(«Applichem»,Германия),фура-2/АМ("Calbiochem");дигитонин,ЭДТА,мембранныефильтрыGF/C(«Whatman»,Великобритания),комплектреагентовдлявыделенияРНК/ДНКизклиническогоматериала«Рибо-препвариант100»(«ФГУНЦНИИЭРоспотребнадзора»,Россия),комплектреагентов«РЕВЕРТА-L»дляпроведенияреакцииобратнойтранскрипции»(«AmpliSensbiotechnologies»,Россия),«НаборреактивовдляпроведенияРТ-
ПЦРвприсутствииинтеркалирующегокрасителяSYBRGreenI»(«Синтол»,Россия).
Оборудование
ПриборПЦРврежимереальноговремениIsycleriq5(США),PerkinElmerTri–Carb3110(ПроизводительСША),
СпектофлюориметрMPF-4"Hitachi"(Япония),
Центрифуга типа «Vortex» «Microspin FV-2400» («Biosan»,Россия),
Центрифугасбакет-ротором,5804R(«Eppendorf», Германия),
Ареометрспределамиизмеренийот1.060г/смдо1.090г/смASTM120H(«Amarell», Германия),
КамераГоряева(«ОООМинимед», Россия),
МикроскопСХ31,(«Olympus»,Япония),
Ламинарныйбокс(«Ламинарныесистемы», Россия),
Термостатдляпробироктипа«Эппендорф»от25до100°С «Гном»(«ДНК-Технология»,Россия),
Микроцентрифугадляпробироктипа«Эппендорф»до16тысg(«Eppendorf», Германия),
Сцинтилляционныефлаконы(«GreinerBio-One», Австрия).
Приготовлениереактивов
Приготовлениефиколла:4,32гпорошкафиколла-400растворялив48млдистиллированнойводы.
Приготовлениерастворарентгеноконтрастноговещества(урографина):10,14мл75%раствораурографинадоводилидистиллированнойводойдо21мл.
Приготовлениеградиентаплотности:растворыфиколлаиурографинасмешивали.Спомощьюареометраизмерялиплотностьполученногораствора,котораядолжнасоставлять1,077г/см.Еслиплотностьвыше,чемнеобходимо,тодобавлялирастворфиколла,еслиниже–растворурофагина.Градиент
плотностиможнохранитьвтечение30сутокпритемпературе+4всклянкеизоранжевогостекла.
Выделениелимфоцитов:периферическуюкровьизлоктевойвенывобъеме10млбраливпробирку,содержащуюгепарин,вконечнойконцентрации25едв1млкрови.Кровьдолжнабылаотстоятьсявтечение40-60минприкомнатнойтемпературедочеткогоразделенияэритроцитови плазмы.
4а.Вцентрифужнуюпробиркуналивали2-3млградиентаплотности,нанегонаслаивали4-6млотстоявшейсяплазмыиверхнийслойэритроцитов.Соотношениеобъемов градиент:плазмувыдерживаливпределах1:2–1:4.
4б.Пробиркицентрифугироваливтечение40минвбакет-роторесускорением200g(1500-1800об/мин)притемпературе20°С.Впроцессецентрифугированияэритроцитыигранулоциты«проваливались»вградиентиоседалинаднопробирки.Наверхнейграницеградиентаприправильномразделенииобразовывалосьрыхлоекольцобеловатогоцвета,состоящеевосновномизлимфоцитовспримесьюмоноцитов.Надслоемлимфоцитовнаходитсяплазма.Плазмусобираливотдельнуюпробиркудляпоследующегоанализанаиммуноглобулины;лимфоцитыотсасываливсухуюконическуюцентрифужную пробирку.
4в.Ксуспензиилимфоцитовдобавляли3-4млсреды199исодержимоепробиркитщательноперемешивали.Послеэтогопробиркицентрифугировалисускорением200-300gпритемпературе20°С,затемнадосадочнуюжидкостьудаляли,апроцедуру отмывкиповторялиещеодинраз.
4г.Послеотмыванияк0,1млосадкаотмытыхклетокдобавляли0,9млсреды199,суспензиютщательноперемешивали;вчистуюпробиркувносили0,38мл3%растворауксуснойкислотыи0,02млвзвесилимфоцитов;вкамереГоряеваподсчитывалилимфоцитыв100большихквадратахиполученноечислоумножалина50000.Результатсоответствовалколичествулимфоцитовв1млсуспензии.Готовуюсуспензиюлимфоцитовхранилипри4°Свтечении2часов.