6 курс / Клинические и лабораторные анализы / ИФА_диагностика_сифилиса_Ткачёв_В_К_,_Вяткина_Т_Г_
.pdfЗАО «Вектор-Бест»
В.К. Ткачёв Т.Г. Вяткина
ИФА-диагностика сифилиса
Информационно-методическое пособие
3-е издание, переработанное и дополненное
Кольцово
2005
ББК 28
Т48
Уважаемые коллеги!
Впоследниегодыиммуноферментныйанализзанял устойчивое положение среди других методов серологи- ческой диагностики сифилиса и прочно вошел в пов- седневную медицинскую практику во многих регионах России. В данной брошюре мы попытались ответить на некоторые вопросы, которые наиболее часто возни- кают у специалистов, занимающихся диагностикой сифилиса.
Ткачёв Вячеслав Константинович, директор по производству ЗАО «Вектор-Бест»
Вяткина Тамара Геннадьевна, начальник отделения ИФА сифилиса ЗАО «Вектор-Бест»
630128, г. Новосибирск, а/я 102, ЗАО «Вектор-Бест»тел.: (383) 2276-030, 3328-134тел./факс: (383) 3329-444
Т48 Ткачёв В.К., Вяткина Т.Г.
ИФА-диагностика сифилиса. Информационно-методическое пособие. 3-е издание, переработанное и дополненное – г. Новосибирск: ЗАО «Вектор-Бест». 2005. – 48 с.
© ЗАО «Вектор-Бест», 2005
ВВЕДЕНИЕ
Забо ле ва е мость инфек ци я ми , пере да ва е мы ми поло вым путем (ИППП), среди кото рых нема лая доля принад ле жит сифи ли су , во всем мире продол жа ет расти . Россия в этом смысле не явля ет ся иск лю че ни ем . Доста то ч но вспомнить 1997 год, когда уровень забо лева е мо сти сифи ли сом в РФ достиг ката ст ро фи че ских разме ров . В после ду ю щие годы наме ти лись неко то рые поло жи тель ные тен денции : забо ле ва е мость сифи ли сом нача ла снижать ся , достиг нув в 2002 году 119,5 случа ев на 100 тыс. населе ния . Одна ко эпиде ми оло ги че ская ситу а ция по сифи ли су по-преж не му оста ет ся трево ж ной. При этом в послед ние деся ти ле тия во всём мире отме ча ет ся увели че ние доли бессим птом но го сифи ли са и сифи ли са со стёртой клини че ской карти ной , что в коне ч ном итоге приво дит к росту поздних форм забо ле ва ния , таких как висце раль ный сифи лис и нейро си фи лис .Втаких усло ви ях по-преж не му акту аль ной оста ет ся проб ле ма эффе к тив ной диаг но сти ки данно го забо ле ва ния . Особая рольприэтомдолж на отво дить сямето даммассо вого профила к ти че ско го обсле до ва ния насе ле ния (скринин га )сцелью ранне го выяв ле ния инфек ции , что дик ту ет необ хо ди мость повы ше ния требо ва ний к чувст ви тель но сти скринин го вых тестов на сифи лис . Кроме того , в связи со слож ным эконо ми че ским поло же ни ем в стране опасная ситу а ция сложи лась вслужбе крови :опла та крово да чи стиму ли ру ет
вовле че ние в контин гент доно ров группы лиц с повышен ным рис ком забо ле ва ний , пере да ю щих ся поло вым путем . Предуп ре ж де ние пере да чи возбу ди те ля сифи ли са с компо нен та ми крови – важ ная состав ная часть проб ле мы профи ла к ти ки гемо тран смис сив ных ин фекций . В настоя щее время в практи ке службы крови широко ис пользу ют ся высо ко чув ст ви тель ные испеци фи ч ные диаг но сти че ские тесты на сифи лис . Актуаль ной зада чей сего д няш не го дня оста ет ся повсе ме ст ное внедре ние тех же тестов в практи ку серо ло ги че ских лабо ра то рий дерма то ве не ро ло ги че ской службы .
Суще ст ву ю щие на отече ст вен ном рынке диаг но сти че ских средств иммуно фер мент ные тест-систе мы для выяв ле ния анти трепо нем ных анти тел в сыво рот ке (плазме ) крови и лик во ре сего дня прихо дят на смену либо встают в один ряд с тради ци он ны ми класси че ски ми мето да ми серо ди аг но сти ки сифи ли са .
3
АНТИТЕЛООБРАЗОВАНИЕ ПРИ СИФИЛИТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ
Дина ми ка анти те ло об ра зо ва ния при сифи ли се изуче на доста то ч но хорошо .Первы мипосле зара же ниявыраба тыва ютсяиммуноглобу ли ны М, выявля е мые в опре де ля е мых количе ст вах на второй неде ле идости га ю щие мак си маль ной концен тра ции вкрови на6—9неде ле [1]. Затем концен т ра ция их даже без лечения начина ет снижать ся вследст вие заме ны их имму ног ло бу ли на ми класса G, дости гая с те чени ем време ни подпо ро го во го уровня . Реци див забо ле ва ния или пов тор ное зара же ние приво дят кново му нара ста нию концен тра ции IgM, причем в случае реци ди ва антите ла этого класса часто выра баты ва ют ся даже в более высо ких концен т ра ци ях , чем при перви чном инфи ци ро ва нии . После прове де ния эффе к тив но го лече ния концен т ра ция IgM быст ро падает , и, обычно , через 3—9 меся цев они пере ста ют опре де лять ся в сыво рот ке крови [2].
Имму ног ло бу ли ны G в опре де ля е мых коли че ст вах поя в ля ются в крови через 3—4 неде ли от момен та инфи ци ро ва ния . Кон цент ра ция их нара ста ет , на 6-ой неде ле начи на ет преоб ла дать над концен т ра ци ей IgM, и, дости гая макси му ма , сохра ня ет ся на опре де лен ном уровне в тече ние длитель но го времени . После про веде ния эффе к тив но го лече ния концен т ра ция имму ног ло бу ли нов посте пен но снижа ет ся , но проис хо дит это гора здо мед лен нее , чем в случае с IgM. Как прави ло , IgG в опре де ля е мых количе ст вах мо гут обна ру жи вать ся спустя год и более после прове ден ной тера пии , а в отдель ных случа ях – даже спустя деся ти ле тия .
У ново ро ж ден но го первые анти те ла также отно сят ся к классу иммуног ло бу ли нов М [3]. Изве ст но , что при инфи ци ро ва нии пло да они могут синте зи ро вать ся , начиная с 3 меся ца бере мен но сти , а инфици ро ва ние может произой ти на любой стадии ; пассив но же пере не сен ные через плацен ту мате рин ские имму ног ло бу ли ны G у здоро вого неин фи ци рованного ребенка катабо лизиру ются и исче зают только через 12—18 меся цев [4]. Принци пи аль ных отли чий в дина ми ке анти те ло об ра зо ва ния при сифили се у детей в литера туре не встреча ет ся .
4
СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ СЕРОДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА
Дейст вующий приказ Мини стерства Здраво охранения РФ № 87 от 26 марта 2001 года «О совер шенствовании серо логической ди агно стики сифи лиса» пред усматривает исполь зование для серо - и лик вордиагностики сифи лиса следу ющих реак ций:
• Мик рореакция преци питации (МР) с карди олипиновым анти ге ном.
• Имму ноферментный анализ (ИФА).
• Реак ция пассив ной гемаг глютинации (РПГА).
• Реак ция имму нофлюоресценции (РИФ) в моди фикациях.
• Комп лекс серо логических реак ций на сифи лис (КСР), состо я щий из реак ции связы вания комп лемента (РСК) с трепо немным и карди олипиновым анти генами и МР.
• Реак ция иммо билизации бледных трепо нем (РИТ).
При этом нетрепо немные тесты (МР и РСК с кардио липино вым анти геном) исполь зуются лишь как отбо рочные, в то время как трепо немные тесты служат для подтвер ждения их резуль татов. Трепо немные тесты обла дают более высо кими чувст вительностью (РИФ) и специ фичностью (РИФ, РИТ), но техни чески слож ны, поэтому их примене ние огра ничено рамка ми специ ализирован ных учре ждений. Реак ции с карди олипиновым анти геном при простоте их поста новки, отно сительной деше визне, удобст ве для иссле дования большо го коли чества образ цов имеют суще ственное огра ничение–низкуючувст вительностьприперви чном,трети чном и позднем латентном сифи лисе, а также наличие ложно положи тельных резуль татов [5]. По имею щимся литера турным данным чувст витель ность кардио липи новых тестов при первич ном си фили се, напри мер, соста вляет около 70% [6]. Высокий процент лож ноположительных резуль татов карди олипиновые тесты дают при обсле довании бере менных женщин , по неко торым данным – до 27% от обще го коли чества поло жительных резуль татов [7]. Кроме того , лож ноположительные результа ты могут быть вызва ны забо леваниями соеди нительной ткани (таки ми как системная красная волчан ка ), диа бетом, возрас тными изме нениями, онко ло гиче скими забо леваниями и другими [8].
Трепо немныетесты(РИФи,особен но,РСК)также могут давать лож ноположительные результа ты, обуслов ленные пере крёстными реак циями.Пока зано,напри мер,чтовРИФонимогут бытьсвяза ны
5
сборре лиозом, гени тальным простым герпесом [9, 10]. Кроме того , причи ной лож ноположительного резуль тата может быть нали чие в исследу емом образце антител к общим анти генам спиро хет, так как неко торые спиро хеты явля ются частью нормаль ной чело вечес кой флоры [11].
Суще ственнымнедо статкомвсехпере численныхкласси ческих тестов (в отечест венном вариан те) явля ется то, что они не унифи циро ваны. Приоб ретая или полу чая разли чные компо ненты, необ ходи мые для проведе ния анализа , специ алисты диаг ностической лабо ратории выну ждены само стоятельно «подти тровывать» их, подби ратьсоот ветствующиеконт рольныесыво роткиит.д.Приэтом точ ность прово димого анали за зави сит от множе ства фак торов, на чиная от каче ства приоб ретённых реа гентов и закан чивая уровнем квали фикации персо нала лабора тории.
Единст венныйпутьпреодо ленияданно гонедо статка–выпуск коммер ческих тест-систем. За рубе жом в меди цинской практи ке давно иуспешно исполь зуютсякоммерче скиенаборы дляпостанов ки реакций RPR и VDRL (аналоги нашей МР), а также FTA-ABS (аналог РИФабс). Сов сем недав но поя вилась первая отече ственная коммер ческая тест-система для опре деле ния анти тре по немных ан тител в реак ции имму нофлюоресценции в моди фикациях РИФабс и РИФ200 (ЗАО «Вектор-Бест»), кото рая нахо дится на реги страции в МЗ РФ.
Внасто ящее время в отече ственной прак тике, кроме пере численных выше реак ций, широ ко приме няются и другие тесты, в част ности – реак ции, осно ванные на гемаг глютинации (реак ция пассив ной гемаг глютинации (РПГА) или её зарубе жные анало ги – the T. pallidum hemagglutination assay (TPHA) и др.), а также имму ноферментный анализ (ИФА). Явля ясь специ фическими трепо немными тестами и обла дая высо кими чувст вительностью и специ фичностью, они легко выпол няются, не требу ют высо кой про фесси ональной подго товки персо нала и могут быть исполь зованы при обсле довании большого коли чества образцов . За рубежом эти тестыширо коиуспеш ноисполь зуютсядляскринин гаидиаг ностики сифи лиса.Одна комногие иссле дователиотмеча ютболее низкуюпо сравне ниюсРИФабсчувст ви тельностьРПГАнаранних стади яхза боле вания[1;2].Ещеодним недо статкомэтого мето да,посравне нию
сИФА,явля етсясубъе ктивностьвоценке резуль татов.Попыт киав тома тизироватьучетрезуль татовприве дутксниже ниюдоступности
6
этого теста для мелких лабо раторий. По чувст вительности и специ фич ности прово димого анали за ИФА-тесты наиболее прибли жены к РИФабс, кото рая до сих пор счита ется «золо тым стандар том» при испы тании новых мето дов диаг ностики сифи лиса. В то же время, рабо тасИФА-тест-системаминетребу етвысо койпрофес сиональной подго товки специ алистов, так как диаг ностические набо ры, пред лага емые произ водителями, укомпле ктованы всеми мате риалами и реа гентами, необхо димыми для поста новки реак ции, в отти тро ванном виде. Кроме того , все ИФА-тест-системы предусматривают авто матический учёт результа тов, что исклю чает субъек тивность в ихоценке .Отно сительнаядеше визна,простотапоста новкиреак ции, удобст во исполь зования для обсле дования большо го коли чества образ цов позволяют приме нять тест-системы для серо диагностики сифи лиса методом ИФА как скрининго вые, обла дающие, в то же время , высо кими диаг ностическими каче ствами.
Приказ № 87 предпи сывает приме нение МР лишь в каче стве отбо рочного теста при обсле довании насе ления на сифи лис, а в ко личе ственном вари анте и для конт роля эффе ктивности лече ния, заме нив ею количе ственную поста новку РСК с кардио липиновым анти геном. В каче стве отбо рочных тестов для профи лактического обсле дования насе ления мож но также исполь зовать КСР и специ фиче ские трепо немные реак ции – ИФА и РПГА.
РИТ, РИФ, ИФА и РПГА, явля ясь высо кочувствительными и высо коспецифичными реак циями, приме няются в каче стве диаг ности ческих подтвер ждающих тестов.
Приобсле дованиидоно ровнеоб ходимоисполь зоватькомп лекс серо логических реак ций, включа ющий МР и РСК либо МР и ИФА, либо МР и РПГА.
Придиаг ностикескрыто госифи лисанеоб ходимоосуще ствлять поста новку двух специ фических тестов одно временно.
Посколь ку ИФА и РПГА являют ся более высо кочувствитель ными , специ фическими и воспро изводимыми тестами, кото рые мож но исполь зовать в качест ве отбо рочных и подтвер ждающих те стов , предпо лагается осуще ствить до 2006 года заме ну комп лекса серо реакций (КСР) выше указанными реак циями при диаг ностике сифи лиса [12].
7
ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ИФА
ВосновеметодаИФАлежитследующийпринцип:натвердофаз ном носителе (в отечественных тест-системах и в большинстве тест-сис- тем зарубежного производства в качестве носителя используется повер х ность лунокполистироловогопланшета)фиксируетсяантиген возбу дителя инфекции, антитела к которому необходимо выявить. Антиген, иммобилизованный на поверхности твёрдого носителя, принято называть иммуносорбентом. Как правило, в состав набора тест-системы входит уже готовый имму носорбент . Схема иммунологической реакции, которая происходит в лунках планшета при проведении анализа, представлена на рис. 1. В ходе инкубации иммуносорбента с испытуемой сывороткой при наличии в ней антител к данному антигену происходит их связывание в комплекс «антиген–антитело». После удаления несвязавшихся иммуногло булинов следует инкубация с мечеными ферментом антителами к иммуноглобулинам человека (конъюгатом), в ходе которой
Рис. 1. Схема иммуноферментного анализа на иммуноглобулины класса G (IgG).
1 – носитель (поверхность лунки планшета);
2 – антиген;
3 – специфические IgG сыворотки крови;
4 – моноклональные анти-IgG–антитела, меченые пероксидазой хрена (конъюгат).
8
на поверхности носителя происхо дит присоединение к имеющимся комплексам «антиген–антитело» антител, меченых ферментом (в качестве фермента чаще всего используется пероксидаза хрена). После удаления несвязавшегося конъюгата в ходе инкубации с раствором субстрата происходит взаимодей ствие фермента с субстратом, в результате чего разви ва ется цветная реакция, интенсив ность которой зависит от количест ва связанных сыворо точныхантител (вслучаеиспользова ния пероксидазного конъюгата в качестве субстрата применяют перекись водорода в сочетании с ортофенилендиамином (ОФД), 5-аминосалициловой кислотой (5-АСК)илитетраме тилбен зидином (ТМБ)).Результатреакцииоценивается спектрофо тометрически с выводом цифровых данных, что исключает субъективность оценки. Некоторые иммуноферментные тест-системыдопуска ют визуальнуюоценкурезультатов,чтоможет быть полезно при отсут ст вии соответствующего оборудования.
Конъюгат, применяемый в таких тест-системах, может быть получен на основе поликлональных антивидовых антител (напри мер, кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека) или на основе полиили моноклональ ных антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов определённого класса (M,G,А).Взависимостиоттого,какиеантителаиспользованы,тестсисте ма будет выявлять в исследуемом образце или любые специ фические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определённого класса (например, только IgG или только IgM).
По такому принципу построена основная масса отечественных ИФА-тест-систем для диагностики различных инфекций (ВИЧ-ин фекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, ток соплазменная и др. инфекции), в том числе и сифилиса.
В то же время, существуют тест-системы, в которых исполь
зована несколько другая схема (рис. 2) – ИФА с фиксирован ными антителами или «ловушка для антител» (Antibody capture ELISA). Она основана на том, что на твердофазном носителе фиксируются аффинно очищенные антитела , специфически реаги рующие с человеческими антителами определенного класса (IgM, IgG или IgA). В результате инкубации с тестируемой сывороткой антитела этого класса связываются с носителем . Наличие среди них антител, специфических для какого-либо антигена (например, трепонемного), выявляется в ходе инкубации с этим антигеном, меченым ферментом. При инкубации с субстратом в том случае, когда в исследуемом
9
Рис. 2. Схема иммуноферментного анализа на иммуноглобулины класса М (IgМ).
1 – носитель (поверхность лунки планшета);
2 – моноклональные анти-IgM–антитела;
3 – IgМ сыворотки крови;
4 – антиген, меченый пероксидазой хрена (конъюгат).
образце присутствовали специфические антитела, развивается окрашивание раствора. По такой схеме постро ены , например, коммерческие зарубежные тест-системы «Captia Syph G EIA», «Captia Syph M EIA» для выяв ле ния анти тел , соот вет ст вен но , классов G иMквозбудите лю сифили са.Наотечест вен номрынкедиагности че с койпродук ции также суще ст ву ют имму но фер мент ные тест-систе мы для выяв ле ния анти тре по нем ных имму ног ло бу ли нов класса М,
10