Ю.А. Митин
Количество репликатов каждой из исследуемых сывороток определяется количеством аллергенов, на наличие специфических IgE к которым исследуется образец. При этом определение аллерген-специфичских IgE производится из расчета 1 лунка для каждого аллергена.
7.11.В лунки, содержащие калибровочные пробы и контрольную сыворотку, внести по 100 мкл конъюгата Е-1.
7.12.В лунки с исследуемыми сыворотками крови внести по 100 мкл растворов требуемых аллергенов в соответствии с намеченной схемой.
7.13.Инкубировать стрипы при встряхивании в течение 1-го часа в термостатируемом шейкере при температуре +37°С со скоростью 500–800 об/мин.
Примечание: общее время внесения калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых сывороток крови не должно превышать 15 минут, а общее время нанесения аллергенов не должно превышать 10 минут, иначе время инкубации различных образцов будет значительно отличаться, что приведет к неправильным результатам.
7.14.По окончании инкубации удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки 5 раз. При каждой промывке во все лунки добавить по 300 мкл промывочного буфера, приготовленного по п. 7.6 и выдержать в течение 5–10 секунд с последующим декантированием. После последнего декантирования тщательно удалить остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.
7.15.Во все лунки, кроме лунок А1 и А2, внести по 150 мкл конъюгата Е-2.
Приложение2
7.16.Инкубировать стрипы в течение 30 минут в термостатируемом шейкере при температуре +37°С со скоростью
500–800 об/мин.
7.17.По окончании второй инкубации удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки согласно п. 7.14.
7.18.Немедленно внести во все лунки по 100 мкл раствора ТМБ. Инкубировать стрипы в темноте в течение 15 минут в термостатируемом шейкере при температуре +37°С со скоростью 500–800 об/мин.
7.19.Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности,какирастворТМБ,по100мклстоп-реа гента для остановки ферментной реакции, инкубировать в течение 1–2 минут при комнатной температуре (+18…25°С).
7.20.В случае невозможности своевременно измерить оптическую плотность растворов в лунках на фотометре, рамку со стрипами можно хранить при комнатной температуре не более 15 минут.
8. Регистрация и учет результатов реакции.
8.1.Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность раствора в лунках при длинах волн: 450 нм и 405 нм.
Если программа фотометра не позволяет вычитать среднее арифметическое значение оптической плотности лунок А1 и А2, то необходимо пользоваться формулой В-BТ, где ВТ — среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках А1 и А2 и В – значение оптической плотности лунки.
В линейных координатах построить два калибровочных графика в зависимости (ед. опт. плотн.) от концентрации IgE в калибровочных пробах (МЕ/мл): по результатам измерений
140 |
|
|
|
|
|
|
|
141 |
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Лабораторная диагностика аллергических заболеваний
Ю.А. Митин Приложение2
|
|
|
|
|
• |
||||
|
при длине волны 450 нм по значениям оптических плотнос- |
калибровочные пробы и контрольную сыворотку после |
|||||||
|
тей проб В0…В25 построить калибровочный график №1. И |
вскрытия флаконов хранить при температуре +2...8°С не бо- |
|||||||
|
при длине волны 405 нм по значениям оптических плотнос- |
лее 1 месяца; |
|||||||
|
|
|
|
|
• |
||||
|
тей проб В0…В100 - калибровочный график №2. |
конъюгаты Е-1, Е-2 и раствор ТМБ после вскрытия флако- |
|||||||
|
Определение концентрации аналита в калибровочных и ис- |
нов хранить при температуре +2...8°С не более 1 месяца; |
|||||||
|
|
|
|
|
• |
||||
|
следуемых пробах производить следующим образом. |
буферный раствор для промывки лунок, подготовленный к |
|||||||
|
В случае, если значение оптической плотности пробы, изме- |
использованию, хранить закрытым при комнатной темпера- |
|||||||
|
ренноепри450нм,составляетменее2,3ед.опт.пл.,тодлявы- |
туре (+18…25°С) не более 5 суток; |
|||||||
|
|
|
|
|
• |
||||
|
числений следует использовать калибровочный график №1. |
концентрированный буферный раствор для промывки лу- |
|||||||
|
Если значение оптической плотности пробы при длине вол- |
нок и стоп-реагент после вскрытия флаконов хранить при |
|||||||
|
ны 450 нм больше 2,3 ед. опт. пл., вычисления производят по |
температуре +2...8°С в течение всего срока годности. |
|||||||
|
калибровочному графику №2. |
9.2. Для проведения анализа не следует использовать гемо- |
|||||||
|
Примечание: при использовании длины волны 620 нм в качестве |
лизированную и мутную сыворотку крови. |
|||||||
|
референтной, за оптические плотности лунок считают разни- |
9.3. Образцы сыворотки крови хранить при температуре |
|||||||
|
цу между измерениями основной и референтной длинами волн |
+2...8°Снеболее2дней;принеобходимостиболеедлительного |
|||||||
|
(∆450 нм – 620 нм и ∆405 нм – 620 нм). |
хранения (до 3 месяцев) — при температуре -20°С и ниже. Из- |
|||||||
|
9. Условия хранения и эксплуатации набора. |
бегать повторных циклов замораживания-размораживания. |
|||||||
|
9.1. Набор АллергоИФА-специфический IgE должен хра- |
9.4. При вскрытии и растворении лиофилизованных компо- |
|||||||
|
ниться в упаковке предприятия-изготовителя при темпера- |
нентов необходимо следить, чтоб на крышке и стенках фла- |
|||||||
|
туре +2...8°С в течение всего срока годности. Допускается |
конов не оставалось сухого вещества. |
|||||||
|
хранение набора при температуре до +25°С не более 5 суток. |
9.5. При использовании набора для проведения нескольких |
|||||||
|
Срок годности набора — 12 месяцев. |
независимых серий количественных анализов необходимо |
|||||||
|
В случае дробного использования компоненты набора необ- |
иметь в виду, что для каждого независимого эксперимента |
|||||||
|
ходимо хранить следующим образом: |
необходимо построение нового калибровочного графика и |
|||||||
• |
определение концентрации иммуноглобулинов Е в конт- |
||||||||
|
стрипыпоместитьвпакетсэтикеткой(приупаковкестрипов |
||||||||
|
в пакет из 2-слойного полиэтилена), который затем вложить |
рольной сыворотке. |
|||||||
|
впрозрачныйпластиковыйпакетсзамкомигерметичнозак |
9.6. Запрещается использовать стоп-реагенты из наборов |
|||||||
|
рыть. Хранить в герметично закрытом пакете с замком при |
реагентов других фирм-производителей. |
|||||||
|
температуре +2...8°С в течение всего срока годности; |
9.7. Для получения надежных результатов необходимо стро- |
|||||||
|
|
|
|
|
гое соблюдение инструкции. |
||||
142 |
|
|
|
|
|
|
|
|
143 |
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Лабораторная диагностика аллергических заболеваний
Для заметок:
144