2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Общая медицинская микробиология

отмирающих. В этот период клетки переходят на эндогенные субстраты (окисляют запасные вещества, белки, углеводы, липиды). Длительность стационарной фазы различается у разных микроорганизмов. Например, у E. coli она наступает через 18–24 ч, у Azotobacter — через 72 ч с момента внесения инокулята в питательную среду.

F — фаза отмирания, характеризуется массовой гибелью бактерий. В бак-

териальной популяции отмечается образование инволюционных форм, аутолиз под действием собственных ферментов. У бактерий меняются морфологические и биохимические свойства. Гибель может наступить через несколько дней, недель, месяцев.

В эту фазу различают периоды ускоренной гибели (количество живых клеток начинает снижаться с увеличивающейся скоростью), логарифмической гибели (количество живых клеток убывает с максимальной скоростью), уменьшения скорости гибели (количество живых клеток убывает с уменьшающейся скоростью) и стационарную фазу минимума (количество живых клеток минимально).

Данная динамика характерна для периодических (статических) культур с

постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов. Таким образом, неограниченный рост в закрытой от доступа дополнительных питательных веществ периодической культуре невозможен.

Если в питательной среде создают условия для поддержания микробной популяции в экспоненциальной фазе — это хемостатные (непрерывные) культуры.

РАЗМНОЖЕНИЕ

Размножение микроорганизмов — увеличение их концентрации в единице объема среды, направленное на сохранение вида.

Для микроорганизмов характерно:

–разнообразие способов размножения;

–переключение с одного способа размножения на другой;

–возможность одновременного использования нескольких способов;

–высокая скорость размножения.

Способы размножения микроорганизмов:

I. Половой способ размножения наблюдается только у эукариот.

II. Бесполые способы размножения.

1.Равновеликое бинарное поперечное деление (простое деление, изо-

морфное деление, митоз) наблюдается у большинства одноклеточных микроорганизмов (бактерий, риккетсий, простейших, дрожжей), в результате образуются две новые дочерние полноценные особи, наделенные генетической информацией материнской клетки, симметричные в отношении продольной и поперечной оси, сама материнская клетка исчезает.

При этом у большинства Грам+ бактерий деление происходит путем синтеза поперечной перегородки, идущей от периферии к центру (рис. 63, а). Клетки большинства Грам– бактерий делятся путем перетяжки клетки (клетка истончается посередине) (рис. 63, б).

2.Почкование (неравновеликое бинарное деление) наблюдается у пред-

ставителей родов Francisella и Mycoplasma и дрожжеподобных грибов. При поч-

109

ковании материнская клетка дает начало дочерней клетке: на одном из полюсов материнской клетки образуется маленький вырост (почка), увеличивающийся в процессе роста. Постепенно почка достигает размеров материнской клетки, после чего отделяется. КС почки полностью синтезируется заново (рис. 63, в). В процессе почкования симметрия наблюдается в отношении только продольной оси. Между материнской и дочерней клетками существуют морфологические и физиологические различия. Новая дочерняя клетка лучше приспосабливается к меняющимся условиям.

3.Фрагментация нитевидных форм характерна для рода Actinomyces и Mycoplasma.

4.Образование экзоспор характерно для Streptomycetes, дрожжеподобных и плесневых грибов.

5.Особый цикл развития наблюдается у Chlamydia. К делению в клетках макроорганизма способны лишь вегетативные формы хламидий (ретикулярные или инициальные тельца). Их цикл, состоящий из нескольких делений, завершается образованием промежуточных форм, из которых формируются элементарные тельца, дающие начало вегетативным формам. После разрушения стенки вакуоли и клетки хозяина элементарные тельца высвобождаются, и цикл повторяется. Цикл длится 40–48 ч.

6.Множественное деление описано для одной группы одноклеточных цианобактерий. В основе множественного деления лежит принцип равновеликого бинарного деления. Отличие заключается в том, что в этом случае после бинарного деления не происходит роста образовавшихся дочерних клеток, а они снова подвергаются делению (рис. 63, г).

Рис. 63. Способы деления и синтез КС у прокариот:

а — деление путем образования поперечной перегородки; б — деление путем перетяжки; в — почкование; г — множественное деление: 1 — КС (толстой линией обозначена КС материнской клетки, тонкой — заново синтезированная); 2 — ЦПМ; 3 — мембранная структура; 4 — цитоплазма, в центре которой расположен нуклеоид; 5 — дополнительный фибриллярный слой КС

Множественное деление (шизогония) описано также у простейших (маля-

рийных плазмодиев): ядерный материал делится на множество ядрышек, окружается участками цитоплазмы, в результате образуется множество дочерних клеток.

110

Механизм и фазы простого деления:

1.Рост до определенной степени зрелости. Рост клетки не беспределен, и

после достижения определенных размеров она начинает делиться. Во время деления рост клетки замедляется и начинается вновь после деления.

2.Кариокинез (репликация ДНК и деление нуклеоида). Из созревшей ци-

топлазмы поступает сигнал, который активирует ген-инициатор на ДНК. Микроорганизмы под действием гена-инициатора синтезируют белок-инициатор, который действует на ген-репликатор — специальный участок ДНК, с которого начинается удвоение ДНК и деление на две нити.

Деление молекулы ДНК (репликация) происходит по полуконсервативному механизму и в норме всегда предшествует делению клетки. Репликация ДНК начинается в точке прикрепления кольцевой хромосомы к ЦПМ, где локализован ферментативный аппарат, ответственный за деление.

Контакт ДНК с ЦПМ осуществляется посредством мезосом. Репликация, начавшаяся в точке прикрепления, идет затем в двух противоположных направлениях. Возникающие дочерние хромосомы остаются прикрепленными к мембране (рис. 64).

Рис. 64. Репликация хромосомы у бактерий

Механизм репликации ДНК выражается в разрыве водородных связей между ее двумя полинуклеотидными цепями, раскручивании их и синтезе с помощью ДНК-полимеразы вдоль каждой старой цепи новых цепей с комплементарной последовательностью оснований. После расхождения в дочерние клетки по одной

111

старой и одной новой полинуклеотидной цепи между ними восстанавливаются водородные связи и формируется полуконсервативная двухцепочечная ДНК.

В норме существует определенная временная связь между репликацией хромосомы и делением бактериальной клетки. Воздействия различными химическими веществами и физическими факторами, приводящие к подавлению репликации ДНК, останавливают и клеточное деление. Однако при некоторых условиях связь между обоими процессами может быть нарушена, и клетки способны делиться в отсутствие синтеза ДНК.

3.Цитокинез (деление клетки). Параллельно с репликацией молекул ДНК происходит синтез мембраны рядом с мезосомой, в области контакта ДНК с ЦПМ. Образование перегородки приводит к делению клетки. Моментом, инициирующим деление клетки, является окончание репликации ДНК. Это приводит к разделению дочерних молекул ДНК и оформлению обособленных хромосом. Вновь образованные дочерние клетки отделяются друг от друга.

Угнетение синтеза мембраны до окончания репликации приводит к нарушению процесса деления: клетка перестает делиться и растет в длину. У некоторых бактерий образование перегородки не приводит к разделению клеток: образуются многокамерные клетки.

4.Расхождение образовавшихся дочерних клеток происходит в результа-

те лизиса среднего слоя КС. Если после многократного деления в одной плоскости клетки не расходятся, образуются цепочки палочковидных (Bacillus) или сфе-

рических (Streptococcus) клеток или парные клетки (Neisseria). Разъединение клеток возможно с обособлением одной из клеток путем движения по поверхности другой, в результате бактерии располагаются беспорядочно (Escherichia). Если при разъединении одна из дочерних клеток, не отрываясь от точки деления, передвигается по дуге, создается V-образная форма (Corynebacterium, Bifidobacterium). После бинарного деления и расхождения клеток в нескольких плоско-

стях образуются клеточные скопления разной формы: гроздья (Staphylococcus),

пакеты (Sarcina) (рис. 65).

Рис. 65. Деление кокков

112

Если деление нуклеоида предшествует клеточному делению, образуются многонуклеоидные микроорганизмы. Под влиянием неблагоприятных внешних факторов (соли желчных кислот, УФ-лучи, ПАВ, антибиотики) деление клетки может остановиться с сохранением ее роста. В таком случае возможно образование удлиненных нитевидных клеток.

Период генерации — интервал времени, в течение которого происходит удвоение количества бактерий. Скорость размножения микроорганизмов в этот период зависит от вида микроорганизма, величины и свойств инокулята, состава питательной среды, ее рН, аэрации, температуры инкубации, других факторов. При благоприятных условиях у многих микроорганизмов деление происходит через 15–30 мин (E. coli, S. typhi). У прихотливых микроорганизмов деление осуществляется через 45–90 мин (Streptococcus, Corynebacterium) и даже через

18 ч (M. tuberculosis).

ПОКОЯЩИЕСЯ ФОРМЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

В процессе жизни микроорганизмов наблюдаются 2 стадии онтогенеза:

1.Вегетативная форма, находящаяся в состоянии роста и размножения, жизнеспособная и жизнедеятельная.

2.Покоящиеся формы — жизнеспособные, но не жизнедеятельные формы (стадии) развития микроорганизмов с резко сниженным обменом веществ и энергии. Для них характерно следующее:

– более толстая оболочка, малопроницаемая для различных химических веществ, меньшее содержание воды;

– отсутствуют рост и размножение;

– понижен метаболизм (гипобиоз, анабиоз), отсутствует выделение токсинов и ферментов;

– повышена резистентность к повреждающим факторам внешней среды (антибиотикам, антисептикам, дезинфектантам, температуре) и иммунным факторам организма человека;

– они способны долгое время персистировать в организме или сохраняться во внешней среде.

К покоящимся формам относят:

– споры бактерий и грибов (образуются во внешней среде);

– цисты спирохет и простейших (образуются в организме человека);

– «малые» формы риккетсий;

– элементарные тельца хламидий;

– вирион вирусов.

С некоторыми оговорками к покоящимся формам также относят:

– L-формы бактерий (могут размножаться);

– лизогенные формы вирусов (профаги).

Бактерии, содержащие в геноме профаг, называются лизогенными. Попадание профага в геном бактериальной клетки сопровождается внесением новой информации в бактериальную клетку и часто ведет к изменению свойств лизогенных бактерий:

113

–приобретению токсигенности (способности продуцировать экзотоксины);

–изменению морфологии;

–изменению антигенных свойств и других признаков.

При освобождении профага из лизогенной бактерии последняя подвергается лизису, а профаг превращается в вирулентный фаг, способный репродуцироваться.

ПРОТИВОМИКРОБНЫЕ МЕРОПРИЯТИЯ

Противомикробные мероприятия — совокупность способов уничтожения, подавления жизнедеятельности, снижения численности популяций и ограничения миграции потенциально патогенных для человека микроорганизмов в целях профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

К противомикробным мероприятиям, оказывающим прямое поврежда-

ющее действие на микроорганизмы, относят стерилизацию, дезинфекцию,

антисептику и химиотерапию.

Следует заметить, что в понятийно-терминологическом аппарате противомикробных мероприятий имеют местно противоречивые термины и их толкования. Понятия стерилизация и дезинфекция следует применять к абиотическим объектам внешней среды, различие между ними состоит в полноте микробной деконтаминации. Стерилизация является наиболее надежным и полным противомикробным мероприятием. При стерилизации погибают все микроорганизмы, в т. ч. споры, при дезинфекции происходит снижение численности микроорганизмов и уничтожение потенциально патогенных для человека микроорганизмов. Понятие антисептика следует использовать, когда речь идет об обработке интактных и поврежденных кожи и слизистых оболочек, а также полостей. Химиотерапия предполагает использование химических веществ специфического действия (антимикробных или цитостатических), действующих во внутренней среде организма для лечения инфекций, гельминтозов и опухолей. Асептика является самым емким понятием и включает все виды противомикробных мероприятий (прямые, косвенные и комбинированные).

Следует заметить, что в некоторых учебниках по хирургии терапевтическая антисептика трактуется как антисептика, а профилактическая антисептика как асептика. С микробиологических позиций такая трактовка является неверной.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ

Стерилизация (обеспложивание) (от лат. sterilis — бесплодный) — сово-

купность физических, химических и механических способов полного освобождения объектов внешней среды от вегетативных и покоящихся форм патогенных, УП и непатогенных микроорганизмов (табл. 23).

В медицинской практике стерилизуют медицинский инструментарий и аппаратуру, перевязочный и шовный материал, инъекционные растворы, дренажи, эндопротезы, трансплантаты, маски, халаты, белье, питательные среды, лабораторную посуду.

114

При создании гнотобиотической зоны стерилизации также подвергается воздух помещений (боксов, палат) и все предметы, там находящиеся. Без этого нельзя обойтись в онкогематологических стационарах, отделениях трансплантации.

Выбор способа стерилизации зависит от многих причин. В первую очередь принимаются во внимание преимущества способа стерилизации и способность стерилизуемого изделия выдерживать воздействие параметров обработки.

Цели стерилизации:

–предупреждение заноса микроорганизмов в организм человека при медицинских вмешательствах;

–создание и поддержание безмикробной (гнотобиотической) среды;

–исключение микробного обсеменения (контаминации) питательных сред, культур клеток, реагентов при лабораторных исследованиях;

–предупреждение микробной контаминации и биодеградации (разрушения) лекарственных и диагностических материалов, продуктов.

СПОСОБЫ

Различают физические, химические и механические способы стерилизации.

Физические способы стерилизации. С целью стерилизации могут быть использованы различные факторы физического воздействия на микроорганизмы. Чаще используют высокую температуру, давление, радиационное и инфракрасное излучение.

I. Прокаливание в пламени горелки или спиртовки (фламбирование) в

течение 30–60 с. Так стерилизуют бактериологические петли (раскаляют до красного цвета в верхней части пламени), горлышки пробирок, кончики пинцетов и ножниц, препаровальные иглы, предметные стекла. Гибель микрорганизмов происходит в результате сгорания клеток.

II. Кипячение используют для стерилизации металлических инструментов, стеклянных изделий, резиновых трубок, пробок. При 100 ºС вегетативные формы микроорганизмов и большинство вирусов погибают в течение нескольких минут. Споры бацилл и клостридий выдерживают кипячение в течение нескольких часов, вирус гепатита В — около часа. Кипячение приводит к коррозии металла, острые поверхности быстро тупятся, зеркала темнеют.

III. Паровой способ самый распространенный (до 90 %) в медицинских учреждениях. Так стерилизуют медицинские инструменты, перчатки, халаты, белье, перевязочные материалы, лабораторную посуду, питательные среды для выращивания микроорганизмов.

Чаще стерилизующим агентом является водяной пар под избыточным давлением. Он глубоко проникает в стерилизуемые материалы и быстро уничтожает

115

микроорганизмы в результате коагуляции их белковых структур. По сравнению с сухожаровой стерилизацией автоклавирование более эффективно, т. к. теплоемкость водяного пара больше теплоемкости сухого воздуха при той же температуре. Обязательным условием эффективной стерилизации является одновременное сочетание следующих факторов: температуры, давления, времени и наличия водяного пара в качестве стерилизующего агента.

Паровые стерилизаторы называются автоклавами (рис. 66).

Рис. 66. Схема автоклава

Основные части автоклава:

–наружный кожух для защиты автоклава от механических повреждений;

–водопаровая камера из высококачественной стали для получения пара, она герметично закрывается крышкой с резиновой прокладкой;

–стерилизационная камера, в которую помещается предназначенный для стерилизации материал. Стерилизационная камера снабжена краном для удаления воздуха в начале стерилизации.

Автоклав также оборудован:

–манометром для измерения давления пара;

–термометром для измерения температуры внутри камеры;

–водомерной стеклянной трубкой для измерения уровня воды в водопаровой

камере;

–спускным краном для удаления конденсата из стерилизационной камеры;

–предохранительным клапаном для выхода пара при повышении давления выше необходимого.

Автоклавы бывают стационарные и переносные, горизонтальные и вертикальные

(рис. 67).

116

экрана, который расположен на лицевой панели аппарата. Дисплей позволяет оператору осуществлять выбор рабочего цикла, языка, вводить в память и запоминать фамилию пользователя, настраивать контрастность экрана дисплея, переводить автоклав в режим ожидания. Оператор полностью лишен возможности допущения каких-либо ошибок, ввиду полной автоматизации цикла. Осуществляется постоянный мониторинг температуры и давления в стерилизационной камере. В случае недостаточного количества воды в камере цикл прерывается. Есть звуковое и визуальное оповещение прерывания цикла. Кроме того, электронный дисплей напоминает оператору о необходимости выполнения работ по уходу и сервисному обслуживанию аппарата, а также предлагает ему меню для проведения операций по проверке правильности работы автоклава и диагностики каких-либо отклонений в его работе.

Режим автоклавирования выражают в единицах избыточного давления и продолжительности времени (табл. 24). Выбор режима автоклавирования зависит от свойств стерилизуемого материала.

Автоклавирование проводит специально подготовленный специалист, т. к. работа по обслуживанию аппарата, работающего под давлением, требует подготовки и строгого соблюдения правил техники безопасности.

Для стерилизации термолабильных материалов (например, сложных питательных сред) используют дробную стерилизацию текучим паром при неплотно закрытой дверце автоклава. Она предполагает 3–4-кратное повторение следующего цикла: материал обрабатывают 30–60 минут текучим паром в автоклаве при температуре 100 ºC или выдерживают на водяной бане при 80 ºC, затем на сутки помещают в термостат при 37 ºC. Во время нахождения в термостате не успевшие погибнуть споры бактерий прорастают в вегетативные формы, которые погибают при следующем цикле обработки.

Тиндализация — более мягкий вариант дробной стерилизации, используют для стерилизации еще более термолабильных объектов. При этом стерилизуемый объект 5–6 дней подряд выдерживают при температуре 56–60 ºC, в промежутках ставят в термостат для прорастания спор.

Тиндализация/дробная стерилизация неэффективна в отношении прионов.

Недостаток парового способа стерилизации связан с тем, что пар превра-

щается в конденсат, вызывающий коррозию металла инструментов, а также увлажняет материалы, что увеличивает риск их реинфицирования.

IV. Воздушный способ. Стерилизация металлических инструментов сухим горячим воздухом проводится в сухожаровых шкафах («сухожарах») (рис. 68). Режимы стерилизации включают температуру и время (табл. 25).

118