3756
.pdfМинистерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования «Воронежский государственный лесотехнический
университет им. Г.Ф. Морозова»
БИОТЕХНОЛОГИЯ
Методические указания к самостоятельному изучению дисциплины для магистров по направлению подготовки 35.04.09 Ландшафтная архитектура
Воронеж 2015
1
УДК630*165.6: 631.147(075.8)
Биотехнология. Методические указания к самостоятельному изучению дисциплины для магистров по направлению подготовки 35.04.09 Ландшафтная архитектура / А. И. Сиволапов; Мин-во обр. и науки РФ, ФГБОУ ВО «Воронеж. гос. лесотехн. университет им. Г.Ф. Морозова». Воронеж, 2015. – 14 с. [Электронный ресурс]
Печатается по решению редакционно-издательского совета ВГЛТУ им. Г.Ф. Морозова.
Рецензент канд. биол. наук, зав лабораторией лесной биотехнологии ВНИИЛГИСбиотех О.С. Машкина
2
ВВЕДЕНИЕ
Биотехнология – наука о методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных биологических объектов (растений, животных и микроорганизмов) для интенсификации производства или создания новых продуктов различного назначения.
Учебная практика по биотехнологии для магистров по специальности Ландшафтная архитектура предусматривает знакомство и приобретение практических навыков по трем разделам дисциплины:
-микроклональное размножение растений с использованием биотехнологии in vitro;
-применение метода ДНК-анализа для генетической паспортизации сортов растений;
-биотехнология in vitro в лесокультурной практике.
Поэтапные вопросы биотехнологии in vitro рассматриваются на базе лаборатории биотехнологии ВНИИЛГИСбиотех.
Применение ДНК-анализа рассматривают на базе отдела генетики Воронежского филиала Центра защиты леса.
Практическое внедрение биотехнологии in vitro в лесокультурной практике рассматривается на базе Учебно-опытного лесхоза ВГЛТУ.
Биотехнологический процесс включает следующие компоненты: биологический агент, субстрат, целевой продукт, аппаратуру и совокупность управляющих ими методов. Регенерация – восстановление целого организма из его части. Наиболее сложной является регенерация растений из отдельных клеток. Особенно трудно этот процесс происходит у древесных растений.
1 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ДИСЦИПЛИНЫ
1.1 Целью изучения биотехнологии является овладение магистрами теоретических основ клеточной и генетической инженерии, практическими навыками клонального микроразмножения растений, в том числе ценных древесно-кустарниковых декоративных пород.
1.2 Для достижения поставленной цели решаются следующие задачи:
ознакомить магистров с основами клеточной и генетической инженерии и с основами современного грибоводства;
освоить приемы, способы и методы вегетативного размножения растений in vitro;
ознакомить с основными биотехнологическими приемами, используемыми в селекции;
освоить способы культивирования грибов-лигнотрофов;
ознакомиться с правовыми основами в биотехнологии.
3
1.3 Дисциплина «Биотехнология» относится к блоку дисциплин по выбору М2.В.ДВ.1.1
2.ТРЕБОВАНИЯ К УРОВНЮ ОСВОЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ДИСЦИЛИНЫ
В результате обучения магистр должен:
Знать основы клеточной и генетической инженерии и современного грибоводства; основные методы биотехнологии; этапы и методы клонального микроразмножения растений; приемы культивирования грибов-лигнотрофов.
Уметь разбираться в особенностях различных биотехнологических
приемов, использовать их в лесохозяйственной практике и ландшафтном строительстве.
3. СОДЕРЖАНИЕ РАЗДЕЛОВ ДИСЦИПЛИНЫ
Раздел 1. ВВЕДЕНИЕ 1.1 Биотехнология как наука; основные этапы развития метода
культуры изолированных тканей и органов.
Предмет изучения биотехнологии; цели, задачи, методы; основные термины и понятия. Правовые основы биотехнологии.
История становления и развития метода культуры изолированных тканей
и органов растений: главные направления исследований, их |
место и |
роль в |
|
системе современной биологической науки. |
|
|
|
Биоинженерия, ее основные направления |
(клеточная |
и генетическая |
|
инженерия), объекты их исследований. |
Использование |
методов |
|
биоинженерии в лесохозяйственной отрасли и ландшафтной архитектуре. |
Раздел 2. КЛЕТОЧНАЯ И ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ
2.1 Культивирование изолированных растительных клеток, тканей и органов; гормональная регуляция процесса.
Особенности метода культивирования растительных тканей in vitro и
перспективы его использования |
в лесной селекции. Оборудование и |
|
организация лаборатории по культуре тканей. |
||
Питательные среды: |
состав, |
приготовление, стерилизация. Техника |
введения растительной |
ткани |
в культуру; условия культивирования |
изолированных тканей.
Фитогормоны: классификация, функции, механизм действия, взаимодействие в растении; роль в регуляции экспрессии генов, активности ферментов. Использование фитогормонов и синтетических регуляторов роста при культивировании растительных тканей: индукция каллусогенеза и органогенеза.
4
2.2 Типы культур клеток и тканей
Культура каллусных тканей. Дедифференцировка растительных тканей
in vitro как основа |
каллусогенеза. Гормональная |
регуляция |
процессов |
|
дедифференцировки. |
|
|
|
|
Характеристика |
каллусных клеток, их |
физиолого-биохимические и |
||
генетические особенности. Изменчивость |
генома |
растений в |
процессе |
дедифференцировки и каллусообразования in vitro. Культура клеточных суспензий и одиночных клеток.
Гормононезависимые растительные ткани. Культура меристематичских тканей.
2.3 Индуцированный морфогенез в культуре каллусных тканей
Факторы, определяющие ндуцированный морфогенез в культуре каллусных тканей.
Типы вторичной дифференцировки каллусной ткани: цитогенез, гистогенез, морфогенез, органогенез, соматический эмбриогенез. Схема вторичной дифференцировки в каллусных тканях, факторы, влияющие на дифференцировку. Гормональная регуляция дедифференциации и вторичной дифференцировки растительных тканей.
2.4 КУЛЬТУРА КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА
Биотрансформация – основа биотехнологического процесса. Получение биологически активных соединений с использованием методов клеточной и тканевой инженерии. Преимущества этих методов в сравнении с традиционным использованием растительного сырья. Вещества, получаемые с помощью клеточных технологий их использование.
Технологии выращивания клеточных культур для получения веществ вторичного синтеза. Субкультивирование, обновление культуры. Биореакторы применяемые в промышленном производстве веществ вторичного синтеза с помощью клеточных технологий, их классификация.
Раздел 3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ В СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ
3.1 Клональное микроразмножение растений; возможности его использования в современном лесохозяйственном производстве
Суть метода, его преимущества перед традиционными способами размножения, особенности использования при работе с древесными породами.
Этапы и методы клонального микроразмножения, техника культивирования растительных тканей на разных этапах.
Влияние генетических, физиологических, гормональных и физических факторов на клональное микроразмножение растений. Цикл клонального микроразмножения.
5
Реювенилизация: способы ее проведения; методы и техника. Оздоровление посадочного материала от вирусов и другой инфекции
(культура меристем, методы термо- и хемотерапии).
Практическое использование метода клонального микроразмнжения, перспективы его применения в современном лесохозяйственном производстве.
3.2 Биотехнологические приемы, используемые в селекции как вспомогательные методы получение гаплоидов in vitro и использование их в
селекции. Применение методов культуры |
тканей |
при |
отдаленной |
гибридизации и семеноводстве. |
|
|
|
Методы получения гаплоидов in vitro: |
из пыльников |
(андрогенез), |
семяпочек (гиногенез), гибридного зародыша (партеногенез).
Получение на основе гаплоидов гомозиготных диплоидов и полиплоидов. Теоретическое и практическое значение гаплоидов.
Преодоление последствий отдаленной гибридизации: прогамной и постгамной несовместимости (оплодотворение in vitro и культивирование незрелых гибридных зародышей). Размножение отдаленных гибридов с использованием метода культуры тканей.
3.3 Сохранение генетических ресурсов с использованием методов клеточной инженерии
Понятие генофонда, проблема сохранения существующего генетического разнообразия лесов (генетического потенциала популяций). Традиционные методы сохранения генофонда древесных растений in situ и ex situ.
Использование биотехнологических приемов для сохранения генетического фонда: преимущества и перспективы.
Живые коллекции: растущие (пересадочные) культуры, депонирование in vitro, сохранение растительных тканей в криобанках. Методы и техника криосохранения. Определение жизнеспособности и генетической стабильности растительного материала после длительного хранения: приемы
иметоды.
3.4САМОСТОЯТЕЛЬНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ ФОРМ И СОРТОВ РАСТЕНИЙ. КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИЙ. СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
Сомаклональная и гаметоклональная вариабельности как источники генетического разнообразия in vitro для создания растений-регенерантов с новыми свойствами. Природа и механизм возникновения сомаклональной изменчивости; факторы, влияющие на ее проявление.
Использование сомаклональных вариантов в селекционной практике; возможность ускорения селекционного процесса.
6
Получение генетически измененных форм растений с помощью мутагенезa in vitro. Особенности культивирования тканей, подвергшихся мутагенному воздействию.
Селекция растений на клеточном уровне, используемый растительный материал. Техника проведения экспериментов по клеточной селекции: подходы и методы. Каллусные культуры как объект клеточной селекции, получение стабильно устойчивых линий каллусных клеток. Протопласты как объект клеточной селекции. Способы получения протопластов. Схема выделения и культивирования протопластов из клеток растений. Теоретическая и практическая значимость протопластов для решения вопросов селекции. Создание неполовых гибридов (соматическая гибридизация) методом слияния изолированных протопластов. Виды соматических гибридов, их характеристика и особенности. Значение соматической гибридизации, возможности ее использования в селекции.
3.5 Клеточная селекция растений. Получение растений-регенерантов, устойчивых к различным факторам
Использование методов клеточной селекции для получения растений-
регенерантов устойчивых |
к абиотическим |
факторам. Отбор |
клеточных |
|
линий |
устойчивых к |
засухе, засолению, |
солям тяжелых |
металлов, |
экстремальным температурам.
Клеточная селекция in vitro как способ отбора растений на устойчивость к патогенным организмам. Схема клеточной селекции растений на устойчивость к грибным болезням.
Раздел 4. СОЗДАНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОГРАММ С ПОМОЩЬЮ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ. ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ.
4.1 Цели, задачи, объекты, основные методы исследований генетической инженерии.
Основные методы создания рекомбинантных ДНК: расщепление ДНК (рестрикция), гибридизация нуклеиновых кислот, клонирование ДНК, определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование), химикоферментативный синтез полинуклеотидов.
Основные ферменты генетической инженерии: ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы, нуклеазы, рестриктазы. Конструирование рекомбинантных ДНК: соединение фрагментов с одноименными “липкими” концами, соединение фрагментов с разноименными концами, соединение фрагментов по “тупым” концам.
Безопасность экспериментов связанных с генно-инженерными исследованиями.
4.2 Генетическая инженерия растений
Использование методов генетической инженерии в селекции растений.
7
Природные векторные системы на основе Ti и Ri плазмид (плазмиды, фаги). Основные этапы получения трансгенных форм растений. Трансформация растительных клеток: методы кокультивации с агробактерией и прямого переноса генов в растение (биобаллистика). Экспрессия чужеродных генов в геном растений.
Улучшение качества и повышение продуктивности растений методами генетической инженерии. Получение трансгенных растений, устойчивых к патогенам, насекомым, гербицидам, стрессовым факторам.
Значение разработок по генетической инженерии в современном сельскохозяйственном производстве.
Правовые основы в биотехнологии.
Раздел 5. ГРИБОВОДСТВО КАК ОТРАСЛЬ БИОТЕХНОЛОГИИ
5.1Культивирование съедобных грибов: возможности и перспективы
Общая характеристика грибов, их место в системе органического мира. Культивируемые грибы: история вопроса, становление и развитие грибной индустрии, современное состояние грибоводства. Грибной бизнес в России.
Экологическая, пищевая, лекарственная ценность грибов. Разведение грибов в искусственных условиях, возможность утилизации отходов сельскохозяйственного, лесного, бумажного перерабатывающего производств. Цикл культивирования грибов. Интенсивная и экстенсивная технологии.
5.2Промышленное выращивание грибов-лигнотрофов
Технологии культивирования вешенки (Pleurotus spp.) и шиитаке (Lentinus edodes): особенности процесса. Штаммовое разнообразие культивируемых грибов.
Факторы роста и плодоношения при искусственном выращивании грибов.
Принципы выбора субстрата для интенсивного культивирования вешенки и шиитаке; источники получения сырья. Состав органических и минеральных веществ субстрата; использование питательных добавок. Способы подготовки субстрата.
Закономерности плодоношения и способы повышения урожайности.
5.3 Выращивание почвенных сапротрофов (шампиньона, кольцевика), некоторых видов микоризных и экзотических грибов
Пищевая ценность шампиньонов. Компосты для культуры шампиньона, технологии их приготовления, роль физических факторов. Экологические аспекты в шампиньоноводстве.
Технология выращивания гриба; болезни и вредители шампиньонов, мероприятия по защите урожая.
Особенности культивирования кольцевика.
8
Выращивание грибов-микоризообразователей: разведение трюфелей, попытки культивирования белого гриба.
Культивирование экзотических видов грибов: разведение сморчков, культивирование фламуллины бархатистоножковой (опенок зимний), опенка летнего, сморчков.
4 ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ
Адвентивные почки – почки, возникшие из тканей и клеток в растениях, обычно их не образующих.
Апикальное доминирование – явление подавления роста боковых почек побега в присутствии терминальной среды.
Андрогенез – процесс возникновения растения из микроспоры или пыльцевого зерна, либо через гаметический эмбриогенез, либо образованием каллюса.
Анеуплоид – ядро, клетка, организм с числом хромосом, отклоняющимся от Х и от чисел, кратных Х.
Биотехнология – наука о методах и технологиях производства
продуктов с использованием биологических объектов.
Гаплоид – ядро, клетка, организм, характеризующиеся набором
хромосом, представляющим половину полного набора, свойственного виду
(символ n).
Генотип – совокупность генов организма.
Гиногенез – процесс возникновения растения из клеток зародышевого мешка.
Генная инженерия – совокупность методов молекулярной генетики,
направленных на получение рекомбинантных нуклеиновых кислот,
осуществление манипуляций с генами.
Дедифференциация – переход специализированных, неделящихся клеток к пролиферации.
Денатурация биополимеров – изменение структуры молекулы,
вызывающее потерю еѐ естественных свойств.
9
Диференциация – комплекс процессов, приводящих к различиям между дочерними клетками, а между материнскими и дочерними клетками.
Диплоид – ядро, клетка, организм, характеризующийся двойным набором хромосом, представленных числом, характерным для данного вида (символ 2n).
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) – биологический полимер,
носитель наследственной информации всех живых организмов. В ядре клетки
она представлена в виде хромосом.
Каллус – ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток органов растений.
Кариотип – набор хромосом, характерный для данного вида.
Клон – культура, возникшая из одной клетки.
Клональное микроразмножение – получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному.
Клеточная селекция – метод выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций с помощью селективных условий.
Культура зародышей – стерильное выращивание на питательной среде незрелых или зрелых изолированных зародышей.
Лиофилизат – продукт лиофилизации (способ мягкой сушки вещества)
Линия – культура, возникшая из штамма путем селекции или клонирования, имеющая маркерные признаки.
Митотип – генотип по митохондриальной ДНК.
Моноплоид – ядро, клетка, организм, характеризующийся основным числом хромосом (символ Х).
Морфогенез in vitro – развитие формы или структур (почек, корней, эмбрионов) при регенерации в культуре тканей.
Мутация – изменение в генетическом материале клеток путем перестройки ДНК ядер и органелл, изменения структуры хромосом или путем полиплоидизации.
Органогенез – процесс возникновения в неорганизованно растущей массе каллюсных клеток зачатков органов (корней и побегов).
10